植物總蛋白提取試劑盒-通用型

Plant Total Protein Isolation Kit（for general use）

● 產(chǎn)品組成：

● 產(chǎn)品簡介

本產(chǎn)品能夠有效裂解各種植物器官（如葉片，根，莖，果實，種子，花），去除各種植物樣品（包括富含次生代謝物質和多糖多酚的植物）中常見的污染，如多糖，多酚，脂類，色素，次生代謝物等，得到的高純度蛋白樣品，可以用于SDS-PAGE凝膠電泳，Western印跡分析以及雙向電泳（2D電泳）。

該試劑盒含有除丙酮外的其他所有試劑，使用方便，能在3小時內得到高純度的蛋白樣品。

按照每次提取使用0.7ml試劑B計算，該試劑盒可以至少使用20次。

●  使用方法：

實驗準備材料：

液氮；研缽；1.5ml離心管；一次性注射器；丙酮；80%丙酮；70℃水浴鍋；干浴器；冷凍離心機；制冰機；渦旋振蕩器。

一. 樣品破碎：

1.1 取植物樣本，在液氮條件下，用研缽充分研磨成粉末。

關鍵步驟：此步驟非常重要，樣本研磨越細越好，研磨不徹底會導致蛋白濃度偏低。

二. 沉淀雜質：

2.1 取1.5 ml離心管，加入1 ml即用型試劑A（按照下表配制），迅速將約0.1克粉末加入其中，漩渦混勻，RT 放置5分鐘。

關鍵步驟：樣品粉末量不能超過0.1克，否則將導致蛋白提取得率和純度大大降低。

即用型試劑A-樣本雜質去除劑配制

2.212000g4℃離心5分鐘，去除上清，保留沉淀。

注：觀察沉淀顏色，如沉淀顏色為綠色，繼續(xù)步驟2.3；如沉淀顏色為淺色或白色，直接進行步驟2.4。

2.3 沉淀中加入1 ml即用型試劑A，漩渦混勻，RT放置5分鐘，12000g4℃離心5分鐘。

2.4 沉淀中加入1 ml 預冷的丙酮（自備，試劑盒不提供）和10 μl DTT溶液，漩渦震蕩（此時溶液狀態(tài)應為白色懸液），徹底重懸，12000g4℃離心5分鐘，去除上清，收集沉淀。

2.5 快甩離心數(shù)秒，殘留上清用移液器徹底吸棄，沉淀物通風晾干1-2分鐘至沉淀干燥。

 關鍵步驟：沉淀不能過分干燥，否則會影響以下步驟蛋白的溶解性。

三. 蛋白粗提：

3.1 蛋白沉淀中加入0.7 ml 即用型試劑B（按照下表配制），漩渦震蕩，徹底重懸沉淀（此時溶液狀態(tài)為淡藍色的懸浮溶液）；70℃水浴1小時，間歇混勻。

即用型試劑B-植物蛋白提取緩沖液配制：

3.212000g4℃離心10分鐘，小心取上清（通?？扇?00 μl，溶液為淡藍色）于1.5ml離心管中，不要吸取沉淀。

注：此步驟得到的蛋白溶液可以進行大多數(shù)蛋白實驗，如WB。如要進行雙向電泳（2D電泳）實驗，繼續(xù)以下步驟。

四. 蛋白純化：

4.1 加入與上清等體積的試劑C（注：試劑C上層為保護相，應該吸取下部的淡黃色液體），劇烈顛倒震蕩后常溫放置1-2分鐘，12000gRT 離心5分鐘，溶液分成兩層，上層溶液為藍色，蛋白位于下層溶液中。

注：試劑C有腐蝕性，請在通風櫥內操作，注意防護。

4.2 用一次性注射器小心吸取下層溶液（通?？扇?50 μl）于1.5 ml離心管中，加入等體積試劑D，劇烈顛倒混勻，12000gRT 離心5分鐘，蛋白位于上層溶液中，收集上層溶液（通?？扇?50-200 μl）于1.5ml離心管中。

五. 蛋白沉淀：

5.1 蛋白溶液中加入5倍體積溶液E（注意是否已經(jīng)按照標簽所示加入甲醇），顛倒混勻，此時可見有絮狀沉淀生產(chǎn)，-20℃ 沉淀30分鐘。

    注：微量蛋白的提取可以-20℃過夜沉淀。

5.212000g4℃離心10分鐘，收集蛋白沉淀，去除上清。

注：正常的蛋白沉淀接近無色，如顏色為褐色或淡黃色說明蛋白不純，不能用于雙向電泳實驗。重復步驟3.1-5.2，直至蛋白沉淀接近無色。

5.3 沉淀中加入1ml 溶液E（注意是否已經(jīng)按照標簽所示加入甲醇），徹底重懸沉淀，12000rpm4℃離心5分鐘，棄上清。

5.4 沉淀中加入1ml預冷的80%丙酮（自備，試劑盒不提供）和10 μl DTT，徹底重懸沉淀，12000g4℃離心5分鐘，棄上清。

5.5 快甩離心數(shù)秒，殘留上清移液器徹底吸棄，沉淀物通風晾干1-2分鐘至沉淀干燥。

   關鍵步驟：沉淀不能過分干燥，否則不好溶解。

六. 蛋白溶解：

6.1 沉淀中溶解于適量PBS溶液或者適當體積樣品緩沖液溶解，-20℃或-80℃貯存。

注： ① 如進行雙向電泳，樣品溶于雙向電泳樣品緩沖液中；如進行單向電泳，樣品溶于1×SDS-PAGE 上樣緩沖液中。

 ② 由于提取過程中使用了DTT，為了避免DTT對蛋白濃度測定的干擾，蛋白定量時盡量選擇Bradford方法。